Diego de Austria, Príncipe de Asturias

Para el día de su nacimiento aún no pasaban dos meses de la muerte de su hermano Carlos Lorenzo. Fue bautizado el 25 de julio y le fue impuesto este nombre en homenaje al patrón de España, el apóstol Santiago. Fue llevado hasta la pila por el duque de Alba.​ Cuando contaba con tan solo tres años falleció Fernando, el mayor de sus hermanos varones, lo que lo convirtió en Príncipe de Asturias, heredero de la Monarquía Hispánica.

Fue jurado príncipe el 1 de marzo de 1580.​ El ascenso de su padre al trono portugués en el año 1580 lo convirtió también en el heredero del trono luso y de su imperio colonial. Su madre Ana murió durante un viaje a su nuevo reino y Diego y sus hermanos permanecieron en Madrid al cuidado de sus hermanas mayores Isabel Clara Eugenia y Catalina Micaela. Las cartas de Felipe II dejan claro que estaba orgulloso de Diego: escribió que con cinco años ya conocía el alfabeto y la danza. En una carta fechada en 1582, el rey escribe al virrey de la India Francisco de Mascarenhas ordenándole que trajera un elefante al príncipe de Asturias como regalo. Felipe enseñó a su hijo el portugués para que en un futuro pudiera hablar con sus nuevos súbditos. Además, planeó desposar a Diego con una de las hijas de Juan, duque de Braganza y Catalina de Portugal.

Pero Diego nunca se convertiría en rey. Al igual que al príncipe Fernando, a Don Diego murió cuando tan solo contaba siete años de edad, debido a la difteria. El título pasaría al siguiente de sus hermanos, el infante Don Felipe, futuro Felipe III de España, débil y enfermizo. El rey ordenó realizar oraciones continuas en la iglesia de Nuestra Santísima Señora en Zaragoza pidiendo por la salud de los infantes reales. Los restos mortales de Diego reposan junto a los de su hermano mayor el príncipe Fernando en el Monasterio de El Escorial.